[发明专利]鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法

摘要

鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法属于生物技术领域，涉及一种利用反义基因技术改造野生核型多角体病毒(NPV)，构建新型鳞翅目害虫NPV的方法。发明方案主要包括以下几个步骤：①尺蠖等鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)保守序列克隆；②鳞翅目害虫反义CS基因转移载体构建；③重组NPV；④通过PCR等方法对重组NPV进行验证；⑤以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。用本发明方法改造后的NPV具有更快的扩散和再侵染速度，并对鳞翅目害虫具有更高毒力。

主权项

1、鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法，其特征在于如下步骤：(1)根据鳞翅目害虫CS基因保守序列设计2-4对包含酶切位点的特异引物，提取害虫mRNA，并进行RT-PCR，获得CS基因保守序列，并进行序列分析验证；(2)将验证后的CS基因RT-PCR产物纯化后连入pUCm-T载体，并转化大肠杆菌，经过抗性筛选和PCR验证，获得包含CS保守序列的T载体(pUCm-T-CS)；(3)以特异的内切酶酶切pUCm-T-CS载体回收包含CS基因的特异片段，并反向导入同样酶切后的包含多角体基因(ph)的NPV转移载体pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr；(4)将pFASTBacI-ph-CSr转化包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，形成重组的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)；(5)NPV-CSr侵染草地夜蛾细胞株sf9扩增，获得完整的重组病毒；(6)通过PCR方法对重组NPV进行验证，以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。