[发明专利]同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法

摘要

本发明提供一种同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法，属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒核苷酸序列分别设计两对特异性引物TB2F/TB2R(检测烟草丛顶病毒)及TVCPF/TVCPR(检测烟草扭脉病毒)。提取植株组织的总RNA后，采用双重RT－PCR的方法，同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。该发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法和传统RT－PCR方法的缺点，只用相当于一次普通RT－PCR的时间和试剂，就可以方便、特异、灵敏的同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。

主权项

1、同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法，包括以下步骤：(1)引物设计：①设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，引物序列如下： TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′ TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′②设计扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的特异性引物对TVCPF/TVCPR，引物序列如下： TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′ TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′③引物对扩增目的核酸带的大小如下： 引物名称 引物序列 检测病毒名称 目的片段大小 TB2R TB2F TVCPF TVCPR 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′ 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′ 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′ 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′ 烟草丛顶病毒 烟草扭脉病毒 550bp 620bp (2)总RNA提取：①称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨。研磨液倒入1.5mL离心管中；②在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；③12,000rpm离心10min；④上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；⑤12,000rpm离心10min；⑥弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；⑦沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入以下试剂： 试剂名称 浓度 用量 5×AMV BUFFER dNTPs RNase Inhibitor AMV Reverse Transcriptase 10mM/dNTP 40u/μL 5u/μL 4μL 2μL 0.5μL 1μL轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；②PCR扩增：加入以下试剂： 试剂名称 浓度 用量 10×PCR Buffer dNTPs MgCl2 TB2R TB2F TVCPF TVCPR cDNA产物 Tag DNA polymerase ddH2O 10mM/dNTP 25mM 20μmol/L 20μmol/L 20μmol/L 20μmol/L 5u/μL 5μL 2μL 3μL 1μL 1μL 1μL 1μL 2μL 1μL 33μL轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、53-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-40次循环，最后72℃延伸10min；(4)电泳检测：取5μL PCR产物经1％-3％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，在仅感染烟草扭脉病毒的烟株中可以扩增到一条620bp的核酸带，而复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株中可以同时扩增到550bp和620bp的核酸带。