[发明专利]利用叶片培植体通过基因枪得到转基因茶叶

摘要

本发明涉及通过基因枪来制备转基因茶叶(camellia sinensis(L.)O.Kuntze)。

主权项

1.利用基因枪制备转基因茶叶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)的360种参数的新结合，其包括：(r)在将360种组合用于叶片培植体之前，将叶片培植体用选自单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等不同浓度(0.25-0.75M)的不同渗透剂以及液态基础MS培养基进行处理(Murashige T.andSkoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue cultures.Physiol.Plant.15：473-497；1962)，其中培养基中添加了维生素样的维生素B1-HCl(0.1mg/l)、维生素B6-HCl(0.5mg/l)、以及尼克酸(0.5mg/l)，并添加了氨基乙酸(2.0mg/l)，处理时间在2至8小时之间变化；(s)在透明聚乙烯膜上画直径在2.0-9.0cm范围内变化的同心圆，其中最外层圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同；(t)排列叶片培植体，使近轴表面在再生培养基上部，用于轰击；(u)在9.0cm培养皿的同心圆内(2.0-5.0cm)的再生培养基上排列叶片培植体，使BioRad制造的被pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹以最大速度发射；(v)分别用70％乙醇和蒸馏水洗涤3次，对金粒进行消毒；(w)用0.5-1.5ml蒸馏水悬浮60ug金粒；(x)在1.5ml的Eppendorf管中分散25-60ul的上述悬浮液，用于每次的轰击；(y)将50ul的金悬浮液与10ul不同浓度的pRT99GUS质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5M CaCl2和10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐进行混合，并不时震荡搅拌，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮；(z)在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被；(aa)360种组合的形成，其包含：间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)、大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)、以及靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，所述距离用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率；(bb)用基因枪对叶片培植体进行轰击，所述基因枪诸如DuPont、Genebooster，但尤其是Helium动力粒子传输系统，PDS-1000/He(Bio-Rad)在小室压力为22-28英寸汞柱下，具有金粒(0.6-1.6um)，还具有1、2和4ug/ul浓度的DNA以及上述的360种组合，其中通过增加靶距离来优化粒子分散从而避免由于气体震荡以及高粒子分散导致的组织损伤，同时通过降低间隔距离来克服由于微射弹飞行距离的中心错位飞行而导致的组织损伤；(cc)通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次；(dd)在再生培养基上旋转轰击后的培植体，其包括叶、细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织，使之上下倒转，背轴面向上，从而使轰击表面与再生培养基相接触；(ee)在培养室中在25±2℃的条件下，于暗处培养两天；(ff)对轰击的叶子进行GUS表达的检测，该检测是按照Jefferson的方法进行的，在该方法中，GUS(5-溴，4-氯，3-吲哚，β-D葡萄糖苷酸)化学物质与转化的叶片培植体反应生成蓝色的“反应产物”，显示BioRad的pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹进入到了移植组织的细胞内(JeffersonRA 1987，Assaying chimeric genes in plants：The GUS gene fusion system，PlantMol Biol Rep 5：389-405)；(gg)按照Sandal I，Bhattacharya A，Sharma M，Ahuja P.S于2001年提交的专利.′An efficient method for micropropagation of tea(Camellia sinensis)plants using leaf explants′中的方法，两天后在培养室中52umol m-2s-1的冷荧光条件下于正常的16h光周期将轰击后的叶片培植体转移至再生培养基；(hh)最后，每15天后，在含有卡那霉素(250-1100ug/ml)的选择培养基中选择假定的转化株(r)按照Sandal I，Bhattacharya A，Sharma M，Ahuja P.S于2001年提交的专利′An efficient method for micropropagation of tea(Camellia sinensis)plants using leaf explants′中公布的方法，在体外培养物中使来自3-5月大的完全卷曲、半开放或完全伸展的叶片培植体出现萌芽再生(s)按照Sandal I，Bhattacharya A，Ahuja P.S.An efficient liquid culture systemfor tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1)：75-80(2001)中的方法在液态介质中使转基因的芽进行生长繁殖(t)按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行分子鉴定。