[发明专利]抗感冒特异性IgY和复合IgY及其新型制剂

摘要

本发明公开一种抗感冒复合IgY及其新型制剂。本发明技术方案如下：培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体，优选引致普通感冒继发感染的主要致病细菌；制备普通感冒继发感染细菌复合抗原和普通感冒抗原；制备致病病毒免疫蛋制备抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物；分别对特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。本发明的抗感冒病原体的特异性IgY和复合IgY可以在呼吸道和肺部构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。

主权项

1.一种抗感冒特异性IgY，其特征在于抗感冒特异性IgY的制备方法包括下列步骤：A.培养所优选的有代表性的各种致普通感冒的病原体：(1)有代表性的各种血清型鼻病毒培养方法：将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒，收获病毒方法如下：将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；在加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒；培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存；(2)有代表性的各种血清型冠状病毒培养方法：将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒炎研究机构的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素索DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒；培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存；(3)有代表性的各种血清型腺病毒的培养方法：将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱终培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究所的血清型7型、3型和4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞培养病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时将培养瓶冻容三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒；培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存；B.制备引致普通感冒的致病病毒的复合抗原：(1)将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混合物；(2)将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混合物；(3)将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混合物；(4)接着将分别制成的鼻病毒混合物和冠状病毒混合物以及腺病毒混合物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物；(5)将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，然后，加入高速匀浆机中以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，高速搅拌形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原；C.普通感冒继发感染细菌复合抗原的制备：购买示售的肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、1型肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌等6种细菌菌株，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养；将培养好的细菌按以下比例混合匀化：肺炎双球菌 50-30％A型溶血性链球菌 5-15％金黄色葡萄球菌 5-5％1型肺炎克雷伯杆菌 30-10％流感嗜血杆菌 5-15％绿脓杆菌 5-15％然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机以10000-30000rpm转速高速匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制成含全菌和菌体成分的继发感染细菌特殊复合抗原；D.制备致病病毒免疫蛋将采用上述方法制备的普通感冒致病病毒复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；E.制备继发感染细菌免疫蛋将采用上述方法制备的感冒继发感染细菌复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；F.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗体物的制备：首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH值至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物干粉成品，然后进行编码标记；G.抗感冒致病病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化：分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗感冒致病病毒特异性IgY粗提物和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。