[发明专利]用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法

摘要

本发明公开了一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法。它的生产步骤包括，①工程菌发酵：将基因工程菌种经种子培养基活化、发酵培养基培养，小分子伴侣累积在菌体细胞内；②超声波破胞：发酵培养液离心后将菌体细胞用缓冲液重新悬浮，然后用超声波细胞粉碎机破胞，小分子伴侣以可溶形式释放到溶液中；破胞液离心，收集上清液；③亲和吸附：将溶解液用亲和层析柱进行吸附分离，收集含小分子伴侣的洗脱峰；④凝胶分离：将收集的洗脱液加入到凝胶层析柱中，层析分离后收集小分子伴侣洗脱峰；⑤冷冻干燥：将收集液于－40℃下冷冻干燥，即得高纯度的新型小分子伴侣。本发明具有过程高效、工艺简单、生产周期短、操作方便、生产成本低和无环境污染等优点。

主权项

1.一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法，其特征在于它的生产步骤如下：1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入5～150mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，120～280rpm摇床中培养8～30小时，按0.1～10％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，120～280rpm摇床中培养4～12小时，再按0.1～10％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其浓度为25～100mg/mL，25～37℃，120～280rpm摇床中培养2～8小时，然后加入终浓度为0.1～1mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4～12小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4～20℃下以1000～8000rpm的速度离心5～30min，弃上清，用25～150mL0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20～500mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率300～650W，工作时间3～5秒，间隔时间3～10秒，共工作80～150次。4～10℃下10000～18000rpm离心30～90min，收集上清液于4～20℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统上将5～50mL破胞后的离心上清液以0.5～5.0cm/h的线速度进样到Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含0～30mM咪唑和0～500mMNaCl的缓冲液清洗层析柱，清洗1～5个柱体积，最后用含200～1000mM咪唑的缓冲液、以1.0～10.0cm/h进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将0.5～2.5mL上面的洗脱液以线速度0.5～4.0cm/h加到自动层析系统Superdex75凝胶层析柱中，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为8～14mL)，收集体积为2～10mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-35～-45℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得50～350mg白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。