[发明专利]植物克隆技术

摘要

本发明公开一种植物克隆技术，包括液体浅层静止克隆、固定平板克隆、周期性浸渍克隆、连续浸渍克隆和小量悬浮克隆以及脱毒操作，可提高产量和品质，并且无污染无公害，可在生产实践中广泛应用。

主权项

1、一种植物克隆技术，其特征是它包括(1)、液体浅层静止克隆这种方法是将一定密度的游离细胞悬浮液置于培养皿或特制的扁瓶中，在实验室内静止克隆。其优点是培养物与空气接触面积大，通气好，细胞的代谢产物也易于扩散，防止了有害物质的累积浓度过高而对培养物产生毒害，转移培养物或添加新鲜培养液也方便，并便于观察和照相。缺点是易造成悬浮在细胞培养液中的游离细胞局部密度过高或过低，有时也会出现密集的细胞在某一区域连成一片的现象，影细胞的分裂。(2)、固体平板克隆这种方法是先将细胞悬浮于液体培养基中，而后与成分相同但含琼脂(事先融化好)的培养基等体积混合。冷却后培养基在培养皿中形成一平板，游离细胞埋于其中。它的优点是游离细胞在培养基中分布均匀，不会连成一片，并便于定点连续观察细胞的发育情况。而其缺点恰恰是液体浅层培养的优点，因此，游离细胞往往发育速度较慢。(3)、周期性浸渍克隆在这一体系中，通过转床来摇动克隆瓶，使细胞交替地浸没和暴露于瓶内的空气中，保证了组织既可以很好的与培养基接触，又可进行适当的气体交换。外植体一般每隔10min便浸入培养基1min。常用的培养皿是：圆试管(3.5cm×12.5cm)和三角瓶。还用一种奶头瓶，是侧面具有若干突起(“奶头”)的圆瓶，适合于较大容量的培养。在这种瓶内，培养基从试管一端流到另一端，或从奶头流出，从而产生搅动和通气效果。(4)、连续浸渍克隆为了让组织或细胞不停地与培养基接触并保证通气良好，培养瓶需要不断振荡或搅动。台式振荡器可以达到这一效果。克隆瓶用夹子或橡皮底座固定，振荡速度变幅通常为30-400rpm(转/分)。但是一般来说，速度超过150rpm是不适合的。振荡的振幅一般为2-4cm。振荡器可安装在克隆室中，否则就要购置带有振荡器的克隆箱。此外还可应用往复式或回旋式水槽振荡器。(5)、小量悬浮克隆表面玻璃可以作成小规模的培养皿，例如直径5cm的表面玻璃，放在密闭的培养皿中，用一圈湿棉花支撑，能够维持一潮湿的环境。适用于小量悬浮培养器皿是凹槽载玻片或用派热克斯玻璃制成的相应容器。在液体克隆中，应用三种基本体系：成批培养、半连续培养和连续培养。对于成批培养，培养基体积限定，当基本营养耗尽时细胞停止生长。在半连续培养中，定期排出原来培养基并注入新鲜培养基。连续培养有开放和密闭两种型式。在密闭式连续培养中，注入新鲜培养和排出的废旧培养基达到平衡。这一过程的控制有两种方法：(1)、滴定法：用注入限制细胞生长的一种或多种营养物质来调节细胞的生长速率。营养物质注入的速率取决于细胞加倍的时间，通常细胞加倍一次需25-35h。(2)、浊度稳定法：细胞数量的增长达到规定的临界值，培养物出现显著浑浊时，注入新鲜培养基。