[发明专利]用体内产生的ssDNA改变基因表达

摘要

本发明提供了经过在靶细胞中体内产生单链cDNA(ss－cDNA)改变靶细胞中靶核酸序列表达的方法。靶细胞用含有目的序列，反向串联重复序列，和反向串联重复序列3’端的引物结合位点的序列盒转染。靶细胞对该序列盒的转录产生RNA模板，该模板逆转录产生特定序列的ss－cDNA。逆转录酶/RNAseH的编码基因也可以转染进靶细胞。利用ss－cDNA的茎－环结构可修饰ss－cDNA以去掉所有的侧翼载体序列，该茎－环结构是由于反向串联重复序列使得ss－cDNA进行自身折叠形成双链DNA茎而形成的。双链茎含有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点且保留了ssDNA形式的环由目的序列组成，该目的序列可以是任意所需的核苷酸序列。这种设计允许茎环中间体的双链茎被所需的相应限制性核酸内切酶裂解，然后以线性化单链DNA片断的形式释放出环部分，或目的序列。释放的(或裂解的)ssDNA片断含有上述双链茎5′上游或3′下游的最少(如果有的话)序列信息。所得的ssDNA与内源性靶核酸序列结合以改变该序列的表达，其用于如下治疗目的，例如使用核酸的双链或三链结合，定点诱变使基因灭活，经过与特定细胞蛋白质结合和干扰RNA剪接功能使细胞功能被破坏。

主权项

1.改变靶细胞中内源性核酸靶序列的表达的方法，包括如下步骤：将由目的序列及其侧翼的反向串联重复序列和3＇引物结合位点(PBS)组成的序列盒导入靶细胞，该目的序列由核酸序列组成，该核酸序列设计成逆转录时产生能结合内源性核酸序列的核酸序列；从PBS开始逆转录所述序列盒的mRNA转录子以便在细胞中释放单链cDNA转录子；和将该cDNA转录子结合到内源性核酸靶序列上以改变该靶序列的表达。