[发明专利]一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法

摘要

本发明涉及一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法,其包括细胞培养、细胞分防、制片、染色、检测五个部分,具有用血量小、操作简便、过程简单、易于普及等优点。

主权项

1．一种T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，其特征在于其包括T—细胞的培养、分离、制片、染色、检测五个部分；(1)细胞培养：①培养液的制备：培养液的组成成分及配制1000克培养液的用量为：N—(2—羟乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes)3—6g碳酸氢钠1—3gRPMI1640培养基(以干粉量计)5—10gL—谷氨酰胺(LG)0．1—0．3g肝素钠(150u／mg)0．1—0．3g植物血凝素(PHA)5—20mg胎牛血清100—300ml青霉素(80万u／2ml)0．1—0．5ml链霉素(100万u／2ml)0．1—0．5ml余量用蒸馏水补齐；该培养液的PH值为6．5—7．5；②细胞培养：Ⅰ．室温下将冰冻的、上述①步骤制备的T—淋巴细胞培养液解冻；Ⅱ．抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为1∶8—12；Ⅲ．将上述容器置于37℃±0．5℃培养箱中48—96小时；(2)细胞分离：①吸入经过细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分的条件下离心5分钟；②弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；③弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；④弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；⑤弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用；上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液；(3)制片：①将冷冻载玻片置于水平位；②吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；③细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干；(4)染色：①染色液的制备：染色液由A液和B液两部分组成，A液的组成成分及其配比为：硝酸银(分析纯)30—60g，蒸馏水100ml；B液的组成成分及其配比为：明胶1—3g，纯甲酸200—500微升，蒸馏水100ml；细胞染色时，A液与B液的体积比为：1—3∶1；②染色：按如下方法进行细胞染色：Ⅰ．将上述①步骤制备的染色液A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；Ⅱ．将三用水箱预热至80—90℃后恒温；Ⅲ．将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；Ⅳ．向玻片上有细胞悬液处，先后滴加A液和B液，两者的体积比为1—3∶1，混匀后将盖玻片盖上；Ⅴ．待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；Ⅵ．用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色；(5)检测：将上述(4)步骤经过染色的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。